غربالگری سویه های باسیلوس مولد اسید پروتئاز و مقایسه فعالیت کواگولاسیون با آنزیم کیموزین حاصل از کلون ژن در pichia pastoris

پروتئازهای تولید شده توسط گونه های bacillus گروه مهمی از آنزیم های مورد استفاده در صنعت می باشند که تولید پنیر یکی از کاربردهای این پروتئازها در صنایع لبنی می باشد. در جستجو برای جداسازی باکتریهای مولد پروتئاز از 4 نمونه شیر فاسد، با توجه به اینکه مایع رویی کشت قادر به دلمه کردن شیر باشد، 17 باکتری غربال شد. پس از انجام آزمایش های مختلف برای انتخاب بهترین باکتری حاوی آنزیم لخته کننده، در نهایت باکتری 17 انتخاب گردید. با بررسی اثر القا در تولید آنزیم مشخص شد که باکتری 17 در محیط حداقل (محیط فاقد پروتئین) آنزیمی تولید نمی کند و در نتیجه تولید پروتئاز در این باکتری نیاز به القا دارد. به منظور کاهش هزینه تولید آنزیم، از کنجاله سویا بعنوان محیط کشت برای تولید مقرون به صرفه پروتئازهای خارج سلولی استفاده نموده و سپس به روش تغییر یک فاکتور در زمان، تولید آنزیم در باکتری 17 بهینه گردید. با توجه به نتایج بدست آمده، بهترین شرایط تولید آنزیم توسط این باکتری شامل محیط حداقل به اضافه 2% آرد کنجاله سویا، میزان همزنی 60 دور در دقیقه، دمای 37 درجه سانتی گراد، مدت گرماگذاری 48 ساعت و میزان 02/0 مولار کلرید پتاسیم بود که این شرایط میزان فعالیت لخته کنندگی شیر در هر میلی لیتر مایع رویی کشت باکتری را از 1 واحد به 60 می رساند. سپس شناسایی باکتری 17 با استفاده از آزمایش های بیوشیمیایی و تعیین توالی قسمتی از ژن 16s rrna انجام گرفت که نشان داد این باکتری جزء جنس bacillus بوده و از اینرو آنرا bacillus sp. sa87 نام نهادیم. با توجه به مزایای زیاد کیموزین نسبت به پروتئازهای باکتریایی و قارچی، این آنزیم هنوز هم بعنوان بهترین لخته کننده شیر در صنایع لبنی مطرح می باشد. هدف قسمت دیگری از این پژوهش، کلون سازی و بیان ژن پروکیموزین در مخمر p. pastoris بود. ژن پروکیموزین (گوساله) کامل و ژن فاقد اگزون 6 در پلاسمید ppic9k کلون و با کمک الکتروپوریشن به درون سلولهای سویه gs115 انتقال یافت. اینتگریت شدن پلاسمید با بررسی رشد در محیط فاقد هیستیدین تأیید شد؛ همچنین پس از انجام pcr قطعاتی به طول تقریبی 1587 جفت باز معادل ژن پروکیموزین کامل و 1473 جفت باز معادل ژن پروکیموزین فاقد اگزون 6 مشاهده گردید. سپس مشخص شد که اینتگرنتها به لحاظ مصرف متانل یک دسته هستند (mut+) یعنی همگی قادر به مصرف سریع متانل می باشند. به منظور انتخاب مستقیم ترانسفورمنتهای چند نسخه ای، کلون ها در غلظتهای 25/0، 5/0، ? و 2 میلی گرم جنتیسین در هر میلی لیتر محیط کشت رشد داده شدند. کلون 6 (از سری کلونهای حاوی ژن پروکیموزین کامل) و کلون 44 (از سری کلونهای حاوی ژن پروکیموزین فاقد اگزون 6) به مدت 5 روز در حضور 2% متانل القاء شدند. سپس میزان بیان پروتئین نوترکیب در عصاره سلولی و سوپرناتانت آنها (پس از تیمارهای مختلف) توسط الیزا، sds-page و وسترن بلاتینگ مورد ارزیابی قرار گرفتند. در نهایت بیان پروکیموزین فقط در کلون 6 (از سری کلونهای حاوی ژن پروکیموزین کامل) هم در عصاره سلولی و هم در سوپرناتانت دیده شد که بعلت رشد بر روی محیط حاوی 2 میلی گرم بر لیتر جنتیسین احتمالاً چندین نسخه از کاست بیان در ژنوم آن اینتگریت شده است. درمرحله بعد وجود mrna پروکیموزین نوترکیب به کمک rt-pcr بررسی شد که نتیجه فقط برای همان کلون حاوی ژن پروکیموزین کامل (کلون 6) مثبت بود.